El suelo
funciona como reservorio de virus entomopatogenos de lepidópteros plaga. La
técnica de detección per os mediante la incorporación de suelos a dieta
artificial es un método útil para detección de aislados de baculovirus. En este
trabajo se calibró la técnica utilizando una mezcla de suelo artificial a base
de 10% (peso/peso) de turba de esfagno, 20% caolinita y 70% arena, como suelo estándar, según las indicaciones de la OECD para
la evaluación ecotoxicológica de plaguicidas. Se realizó un experimento de
incorporación de suspensiones de poliedros (OBs) del nucleopoliedrovirus
múltiple de Spodoptera frugiperda
(SfMNPV) en suelo artificial a dieta semisintética. Concentraciones de 1x104, 1x105 OBs/ml no
provocaron muertes por infección per os en las larvas de segundo estadio
expuestas. En cambio, concentraciones de 1x106 OBs/ml y 1x107
OBs/ml, el porcentaje de larvas infectadas per os fue del 3% y 4% con 4 días de
exposición a suelo contaminado con OBs y un periodo posterior a la infección de
seis días.
Introducción
La
plaga más importante en el cultivo del maíz para Latinoamérica es Spodoptera frugiperda (J.E. Smith)
(Lepidoptera: Noctuidae). También ataca a otros cultivos como sorgo, algodón,
soya, papa, jitomate y pastos de forrageo (Martínez, 2003). Este insecto
presenta un amplio rango de hospederos y se encuentra ampliamente distribuido
en norte, centro y Sur América (Sparks, 1979). La mayoría de aplicaciones de
insecticidas químicos en maíz están dirigidas al control de éste insecto. Sin
embargo, durante los últimos años se encuentra en desarrollo una alternativa
prometedora y sostenible para su control que consiste en un nucleopoliedrovirus
múltiple de S.frugiperda (SfMNPV, género
Alphabaculovirus, familia
Baculoviridae) que causa epizootias en las poblaciones larvarias de este
insecto. Experimentos de campo mostraron que la prevalencia de infección en
amplios rangos de aplicación de 6x1012 OBs/ha resulta en aproximadamente el 40% de
infección pero la capacidad del virus se encuentra limitada por la degradación
ultravioleta a la que se encuentra sujeto (Martínez et al. 2002).
Materiales y
métodos
Cría de insectos
Se
estableció un pie de cría de S. frugiperda . La colonia se mantuvo a temperatura constante (25 ±
2ºC), y con un fotoperiodo de 16:8 h luz/obscuridad. Las larvas fueron criadas
sobre una dieta semisintética adaptada de Caballero et al. (2001).
Amplificación de inoculo viral de nucleopoliedrovirus
múltiple de Spodoptera frugiperda (SfMNPV).
Un
grupo de 100 larvas de tercer instar de la colonia se colocó individualmente en
recipientes plásticos con tapa de 25 ml. A cada recipiente se le agregó una
larva y un trozo de dieta artificial contaminado superficialmente con una
suspensión de 1 x 108 OBs en un volumen de 10 µl de agua destilada
estéril. Cuatro días después de la inoculación se cambió la dieta contaminada
por dieta no tratada y se revisó la muerte de las larvas durante los 10 días
post-inoculación. Las larvas muertas se colectaron y guardaron a 4°C. Se maceró
la larva infectada y se agregó en un volúmen de 500 µl de polisorbato 80 (Tween
80) al 0.1% (vol./vol.). Se agitó en un vortex durante 30 s y después se pasó
la suspensión por un filtro de malla plástica para eliminar los restos de
tegumento presentes. La suspensión fue centrifugada a 5000 rpm durante 5
minutos y el sobrenadante se desechó. A la pastilla de poliedros se le añadió
500 µl de solución de Tween 80, repitiendo el proceso anterior. Posterior al
segundo centrifugado, se lavaron los restos de Tween 80 con 1 ml de agua
destilada y se realizó un tercer centrifugado a 5000 rpm. Se resuspendió la
pastilla de poliedros con 100 µl de agua destilada y se guardó a 4 ºC. De
una alícuota de la suspensión madre se realizaron tres diluciones de 1/10,
1/100, 1/1000. Se realizó un conteo de OBs presentes en la suspensión con la
ayuda del microscopio óptico con contraste de fases a 400x y una cámara de
conteo Neubauer en donde se colocaron 10 µl de la suspensión de OBs.
Cada conteo se realizó por triplicado. Para calcular la concentración de
poliedros en la suspensión se utilizó la siguiente formula: Concentración de
poliedros = ( no. poliedros en cámara × 5 × factor de dilución)/1x10e-4. Finalmente
se prepararon tres suspensiones para cada una de las siguientes concentraciones
de OBs/ml: 1x104, 1x105, 1x106, adicionalmente
se prepararon 6 suspensiones de 1x107 OBs/ml, se guardaron a 8°C con
tres testigos con 1 ml de agua destilada.
Incorporación de mezclas de OBs y suelo artificial a
dieta semisintética e inoculación per os.
Muestras de suelo artificial
Se elaboró una mezcla de suelo artificial a base de 10% (peso/peso) de turba de esfagno, 20% caolinita y 70% arena (OECDE, 1984). Todos los elementos se cribaron en una malla de 2 mm; el esfagno y la arena fueron lavados, secados a temperatura ambiente y se revolvieron manualmente en un recipiente plástico durante 15 min. Una muestra de 25 g de la muestra total de suelo artificial se colocó en un sobre de papel y se pesó para obtener el peso húmedo, posteriormente se dejó secar a 103-105°C durante 24 horas y se pesó de nuevo. Se preparó dieta artificial semisintética y se colocó un volúmen de 50 ml en un recipiente plástico de 250 ml de capacidad. Cuando la dieta alcanzaba una temperatura inferior a 50 °C se incorporaba una muestra de 10 g de suelo artificial contaminado con 1 ml de suspensión de OBs de SfMNPV. La mezcla se revolvió vigorosamente hasta incorporar el suelo contaminado con OBs en la dieta. Un total de 540 larvas de segundo estadio de S. frugiperda se individualizaron y se les colocó un trocito de dieta artificial contaminada durante cuatro días de exposición. Después de este tiempo, se colocaba un trocito de dieta artificial no contaminada, se cambió la dieta cada dos días durante los 10 días posteriores a la exposición. Se registró la mortalidad diariamente.
Se elaboró una mezcla de suelo artificial a base de 10% (peso/peso) de turba de esfagno, 20% caolinita y 70% arena (OECDE, 1984). Todos los elementos se cribaron en una malla de 2 mm; el esfagno y la arena fueron lavados, secados a temperatura ambiente y se revolvieron manualmente en un recipiente plástico durante 15 min. Una muestra de 25 g de la muestra total de suelo artificial se colocó en un sobre de papel y se pesó para obtener el peso húmedo, posteriormente se dejó secar a 103-105°C durante 24 horas y se pesó de nuevo. Se preparó dieta artificial semisintética y se colocó un volúmen de 50 ml en un recipiente plástico de 250 ml de capacidad. Cuando la dieta alcanzaba una temperatura inferior a 50 °C se incorporaba una muestra de 10 g de suelo artificial contaminado con 1 ml de suspensión de OBs de SfMNPV. La mezcla se revolvió vigorosamente hasta incorporar el suelo contaminado con OBs en la dieta. Un total de 540 larvas de segundo estadio de S. frugiperda se individualizaron y se les colocó un trocito de dieta artificial contaminada durante cuatro días de exposición. Después de este tiempo, se colocaba un trocito de dieta artificial no contaminada, se cambió la dieta cada dos días durante los 10 días posteriores a la exposición. Se registró la mortalidad diariamente.
Tinción de Giemsa en larvas muertas de S. frugiperda
Mediante tinción Giemsa se confirmó que las larvas muertas en el periodo de prueba de diez días, presentaran o no infección por SfMNPV. Para esto, una pequeña porción de la larva fue tomada con la ayuda de un palillo de madera y se realizó un frotis en un portaobjeto. El frotis se fijó con alcohol metílico de 3-4 min. Después se lavó suavemente con agua de grifo. Se agregaron gotas de solución Giemsa y se esperó 30 min. Finalmente el frotis se lavó con abundante agua directo del chorro del grifo para eliminar el exceso de colorante, se secó a temperatura ambiente y se observó al microscopio a 100X con una gota de aceite de inmersión.
Mediante tinción Giemsa se confirmó que las larvas muertas en el periodo de prueba de diez días, presentaran o no infección por SfMNPV. Para esto, una pequeña porción de la larva fue tomada con la ayuda de un palillo de madera y se realizó un frotis en un portaobjeto. El frotis se fijó con alcohol metílico de 3-4 min. Después se lavó suavemente con agua de grifo. Se agregaron gotas de solución Giemsa y se esperó 30 min. Finalmente el frotis se lavó con abundante agua directo del chorro del grifo para eliminar el exceso de colorante, se secó a temperatura ambiente y se observó al microscopio a 100X con una gota de aceite de inmersión.
Resultados y discusión
Las larvas de segundo estadío aceptaron la dieta y se presentaron pocas muertes por causas no específicas en los testigos (9 individuos) durante el periodo de exposición de 4 días a la dieta con incorporación de suelo más 6 días con dieta artificial. Las demás larvas consumieron la dieta y lograron sobrevivir hasta pupar. Las
concentraciones de 1x104, 1x105, 1x106 OBs/ml
en suelo artificial no provocaron muertes por poliedrosis. El porcentaje de
larvas infectadas de S. frugiperda en
el bioensayo de incorporación de mezclas de OBs y suelo artificial a dieta
semisintética e inoculación per os fue del 3% en suelo artificial contaminado
con 1 ml de suspensión de 1x106 OBs/ml, y de 4% con 1x107
OBs/ml. Después de 4 días de exposición a dieta contaminada y 6 días de
observación postratamiento. Esto sugiere que por esta técnica se necesitan
concentraciones más elevadas para ampliar el margen de mortalidades. Mediante
las tinciones Giemsa se confirmó que la muerte de algunas larvas fue por
infección de SfMNPV.
El suelo representa el principal reservorio de muchos virus patógenos de insectos. Los mecanismos de transferencia de virus hacia las plantas han sido poco estudiados pero existe evidencia que algunos baculovirus son transferidos con partículas de suelo, donde se dan interacciones entre minerales en suelos arcillosos con alto contenido de óxidos férricos, atapulgita y caolinita (Christian, 2006) y los microorganismos, humedad y tipo de suelo, pueden afectar la supervivencia de virus en el suelo (Peng et al., 1999). La técnica de incorporación a dieta de Richards y Christian (1999) adaptada por Murillo et al. (2007) demostró tener más sensibilidad que técnicas basadas en PCR o procesos complejos descritos por Ebling y Holmes (2002).
La presencia de poliedros de SfMNPV en suelos de la región del Soconusco Chiapas y la presencia de diferencias polimórficas fue demostrada en trabajos de Jiménez (2003) demostrando que existen cepas silvestres del virus, donde el suelo es el principal reservorio dentro del agroecosistema, en el cual la concentración promedio se encuentra entre 7.0 x 105 y 3.0 x 106 OBs/10g de suelo. El hecho de utilizar un suelo estándar facilita los estudios de laboratorio y brinda una metodología sencilla pero de gran utilidad para el entendimiento de los procesos que modulan la interacción poliedro-suelo de gran importancia ecológica para el virus y las poblaciones del insecto huésped.
Conclusiones
Se observaron 3-4% de muertes por la presencia de SfMNPV en larvas de S. frugiperda de segundo estadio alimentadas per os con un suelo artificial contaminado con poliedros de SfMNPV. Las concentraciones de 1x104, 1x105, 1x106 OBs/ml en suelo artificial no provocaron muertes por lo que en los estudios futuros se utilizarán concentraciones mayores a 1x107 OBs/ml para generar mortalidades elevadas por esta técnica.
Las larvas de segundo estadío aceptaron la dieta y se presentaron pocas muertes por causas no específicas en los testigos (9 individuos) durante el periodo de exposición de 4 días a la dieta con incorporación de suelo más 6 días con dieta artificial. Las demás larvas consumieron la dieta y lograron sobrevivir hasta pupar
El suelo representa el principal reservorio de muchos virus patógenos de insectos. Los mecanismos de transferencia de virus hacia las plantas han sido poco estudiados pero existe evidencia que algunos baculovirus son transferidos con partículas de suelo, donde se dan interacciones entre minerales en suelos arcillosos con alto contenido de óxidos férricos, atapulgita y caolinita (Christian, 2006) y los microorganismos, humedad y tipo de suelo, pueden afectar la supervivencia de virus en el suelo (Peng et al., 1999). La técnica de incorporación a dieta de Richards y Christian (1999) adaptada por Murillo et al. (2007) demostró tener más sensibilidad que técnicas basadas en PCR o procesos complejos descritos por Ebling y Holmes (2002).
La presencia de poliedros de SfMNPV en suelos de la región del Soconusco Chiapas y la presencia de diferencias polimórficas fue demostrada en trabajos de Jiménez (2003) demostrando que existen cepas silvestres del virus, donde el suelo es el principal reservorio dentro del agroecosistema, en el cual la concentración promedio se encuentra entre 7.0 x 105 y 3.0 x 106 OBs/10g de suelo. El hecho de utilizar un suelo estándar facilita los estudios de laboratorio y brinda una metodología sencilla pero de gran utilidad para el entendimiento de los procesos que modulan la interacción poliedro-suelo de gran importancia ecológica para el virus y las poblaciones del insecto huésped.
Conclusiones
Se observaron 3-4% de muertes por la presencia de SfMNPV en larvas de S. frugiperda de segundo estadio alimentadas per os con un suelo artificial contaminado con poliedros de SfMNPV. Las concentraciones de 1x104, 1x105, 1x106 OBs/ml en suelo artificial no provocaron muertes por lo que en los estudios futuros se utilizarán concentraciones mayores a 1x107 OBs/ml para generar mortalidades elevadas por esta técnica.
Literatura citada
Caballero, P., López–Ferber, M. y Williams, T. (2001). Los baculovirus y sus aplicaciones como bioinsecticidas en el control biológico de plagas. Ed. M.V. Phytoma-España, 518pp.
Christian, P., Richards, A., y Williams, T. (2006). Differential adsorption of occluded and nonoccluded insect-pathogenic virus to soil-forming minerals. Appl. Environ. Microbiol. 72: 4648-4652.
Jiménez Fernández, J.A. (2003). Aislamiento y polimorfismo genético del nucleopoliedrovirus de Spodoptera frugiperda (SMITH) en 9 municipios de la región del Soconusco Chiapas, México. Tesis de licenciatura. Universidad de Ciencias y Artes de Chiapas. 82 pp.
Martínez Castillo, A. (2003). Lethal and sublethal interaccions between optical brighteners and nucleopolyhedrovirus in Spodoptera frujiperda (J.E.Smith) (Lepidoptera: Noctunidae) Tesis doctoral. Departamento de Producción Agraria Universidad Pública de Navarrra. 111 pp.
Martínez, A.M., D. Goulson, J.W. Chapman, P. Caballero, R. Cave, and Williams T.(2002). Is it feasible to use optical brightener technology with a baculovirus insecticide for resource-poor maize farmers in Mesoamerica? Biol. Contr.17:174-181.
Murillo, R., Elvira, S., Muñoz, D., Williams, T., y Caballero, P. (2006). Genetic and phenotypic variability in Spodoptera exigua nucleopolyhedrovirus isolates from greenhouse soils in southern Spain. Biol. Control 38:157-165.
Organization for Economic Cooperation and Development (OECD). 1984. Earthworm, acute toxicity test. Guidelines for testing of chemicals N°207. OCDE, París, 9 pp.
Peng F., Fuxa J.R., Richter A.R. y Johnson, J. (1999). Effects of heat-sensitive agents. Soil type, moisture, and leaf surface on persistence of Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera: Noctuidae) nucleopolyhedrovirus. Environ. Entomol. 28:330-338.
Richards, A.R., Christian, P.D. (1999). A rapid bioassay screen for quantifying nucleopolyhedroviruses (Baculoviridae) in the environment. J. Virol. Meth. 82:63-75.
Sparks, A.N. (1979). A review of the biology of the fall armyworm. Fla. Entomol. 62:82-87.
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